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《NatureMethods》是Nature旗下最重要子刊之一，也是方法論領(lǐng)域的權(quán)威刊物，其影響因子自從2004年創(chuàng)刊開始就一路飆升，在2014年已經(jīng)達(dá)到32.072。這個月更期刊的受眾是學(xué)術(shù)和產(chǎn)業(yè)界的從事實(shí)驗(yàn)工作的研究人員。它旨在為研究人員提供新工具來方便研究，NatureMethods強(qiáng)調(diào)方法的實(shí)用性和即時(shí)性。

《NatureMethods》選出了2016您最值得關(guān)注的八項(xiàng)技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記（Proteinlabelingincells）、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（Unravelingnucleararchitecture）、動態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（Proteinstructurethroughtime）、精準(zhǔn)光遺傳學(xué)（Precisionoptogenetics）、高度復(fù)合成像（Highlymultiplexedimaging）、深度學(xué)習(xí)（Deeplearning）、蛋白定位亞細(xì)胞圖譜（Subcellularmaps）、綜合單細(xì)胞圖譜（Integratedsingle-cellprofiles）。另外，《NatureMethods》也選出了2015年最受關(guān)注技術(shù)成果：單顆粒冷凍電鏡。

2016年值得關(guān)注的方法

深度學(xué)習(xí)（Deeplearning）

新的計(jì)算工具從大量的序列數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)復(fù)雜模式。

機(jī)器學(xué)習(xí)中，一個功能強(qiáng)大方法可以讓計(jì)算機(jī)解決感知問題，如圖像和語音識別技術(shù)越來越多地進(jìn)入生物學(xué)。這些深度學(xué)習(xí)方法，如深度人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，使用多個處理層從海量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)模式和結(jié)構(gòu)。每一層都用將前一層從數(shù)據(jù)中學(xué)到的概念作為基礎(chǔ)；級別越高，所學(xué)的概念越抽象。深度學(xué)習(xí)不依賴于預(yù)先數(shù)據(jù)處理并自動地提取特征。舉一個簡單的例子，用于理解形狀的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在第一層中學(xué)習(xí)識別簡單的邊，然后在后續(xù)層中識別由那些邊組成的更復(fù)雜的形狀。深度學(xué)習(xí)的層數(shù)并沒有硬性規(guī)定，但多數(shù)專家認(rèn)為，至少需要兩層。

最近的例子展示了深度學(xué)習(xí)的力量??它可以從基因組DNA序列中找到調(diào)控特點(diǎn)：DeepSEA（Nat.Methods12，931?934，2015）將基因組序列作為輸入，數(shù)據(jù)來源是如ENCODE和EpigenomicsRoadmap這樣的大型數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而預(yù)測單核苷酸變異對調(diào)節(jié)區(qū)域??如DNA酶超敏感位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和組蛋白標(biāo)記??的影響。Basset（bioRxiv，DOI：10.1101/028399，2015）使用類似的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測單核苷酸多態(tài)性在染色體上的影響。DeepBind（Nat.Biotechnol.33，831?838，2015）用深度學(xué)習(xí)發(fā)現(xiàn)RNA和DNA上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，并預(yù)測突變的影響。

深度學(xué)習(xí)在大數(shù)據(jù)的背景下是非常有價(jià)值的，因?yàn)樗鼜拇罅繑?shù)據(jù)中提取出高層次的信息。它在基因組分析的逐步應(yīng)用會解決一些最初的挑戰(zhàn)，如由于稀少訓(xùn)練數(shù)據(jù)的相關(guān)性而產(chǎn)生的過擬合問題，還有高計(jì)算成本問題。學(xué)術(shù)領(lǐng)域和新興公司的（如DeepGenomics，2015年7月22日成立）的研究人員將越來越多地應(yīng)用深度學(xué)習(xí)來進(jìn)行基因組分析和精確預(yù)測藥物。當(dāng)前目標(biāo)是預(yù)測基因變異對細(xì)胞調(diào)節(jié)總體情況和疾病發(fā)展的影響，不管這種變異是自然狀態(tài)下發(fā)生的還是由于基因組編輯引入的。

細(xì)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記（Proteinlabelingincells）

更好的蛋白標(biāo)記技術(shù)會提高成像。

熒光化學(xué)染料相對較小，具有良好的光物理性質(zhì)還有多種顏色，這使它們成為可取代熒光蛋白的備選方案。研究人員正積極開發(fā)在活細(xì)胞中用染料標(biāo)記蛋白的工具。為了實(shí)用，讓染料浸染蛋白的方法必須支持蛋白質(zhì)的特異性標(biāo)記。在這方面，已經(jīng)存在一些工具，如SNAP和Halo標(biāo)簽、Flash和ReAsH和組氨酸標(biāo)記。這些工具包括了一些標(biāo)記靶蛋白并與染料特異性結(jié)合的小分子蛋白或肽。一種替代方法是在翻譯過程中，將非天然氨基酸加入到蛋白質(zhì)中；這里所講的非天然氨基酸或者是熒光的，或者可以通過“點(diǎn)擊化學(xué)”制成熒光。

雖然這些方法日益普及，它們也有如復(fù)合成像方法用途有限問題，低標(biāo)記效率問題和染料能穿過活細(xì)胞膜的數(shù)量和質(zhì)量問題。這種染料的研發(fā)是一個活躍的研究領(lǐng)域。今后的工作無疑將會提高標(biāo)記效率，這將有助于增強(qiáng)定量成像；提高現(xiàn)有染料質(zhì)量，增加復(fù)用次數(shù)，減少必要的成像光劑量；還可能揭示蛋白質(zhì)全新的標(biāo)記方法。

特異性蛋白標(biāo)記也將提高某些活細(xì)胞的超高分辨率成像。隨著解析能力接近幾十納米，標(biāo)記方法脫穎而出。例如，用抗體標(biāo)記會增加結(jié)構(gòu)精度，而且使用二次抗體會更加精確。還有一種替代方案，研究人員正在開發(fā)納米抗體，它是更小的用于標(biāo)記的單鏈抗體。

細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（Unravelingnucleararchitecture）

我們需要新方法來支持高分辨率和高吞吐量地觀察3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。

房地產(chǎn)的口頭禪??“位置比其他都重要”??同樣也適用于哺乳動物的基因組�；�因調(diào)控取決于染色質(zhì)的構(gòu)建和其在細(xì)胞核內(nèi)的三維調(diào)控元件。在特定位點(diǎn)或全基因組范圍內(nèi)的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（capturechromatinconformation，3C）是一種窺探基因組復(fù)雜結(jié)構(gòu)的方式。但想要真正理解這個3D結(jié)構(gòu)，它如何隨時(shí)間演變，以及它對疾病的作用，還需要新方法。由3C衍生出的技術(shù)通常依賴染色質(zhì)相互作用位點(diǎn)的交聯(lián)，還依賴在擴(kuò)增和測序之前這些位點(diǎn)的連接反應(yīng)。這些步驟限制了該方法的吞吐量，使其更支持順式的相互作用，而非反式。最近在復(fù)用?順式相互作用方向上的進(jìn)步包含兩個連續(xù)捕獲步驟，它提高了吞吐量和分辨率，支持弱相互作用和強(qiáng)相互作用的相對定量，還能解釋它們各自的生理作用。

為了讓科學(xué)家們充分理解細(xì)胞核組織的動態(tài)變化，應(yīng)該將基于群體的模型和個體每個細(xì)胞的高分辨率數(shù)據(jù)結(jié)合起來。這將需要多學(xué)科方法來匯集基因組學(xué)，生物物理學(xué)和成像學(xué)的精髓。最近由美國衛(wèi)生國家研究院資助的4DNucleome計(jì)劃，是一項(xiàng)倡議，旨在結(jié)合這種專業(yè)技能并聯(lián)合大型數(shù)據(jù)庫來比對基因組結(jié)構(gòu)，應(yīng)用高分辨率成像并研究細(xì)胞核內(nèi)區(qū)室。其目標(biāo)在于改良工具，這包括改進(jìn)針對單細(xì)胞核小體實(shí)驗(yàn)成像分辨率的實(shí)驗(yàn)計(jì)算方法，和讓基因組折疊的可視化的實(shí)驗(yàn)計(jì)算方法。

一旦細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的比對變成一個更常規(guī)的定量過程，我們將能更好地確定和預(yù)測的突變對基因調(diào)節(jié)和作用機(jī)制的影響??是與疾病有關(guān)，還是在基因組編輯的過程中引入。我們甚至能夠特異性改變基因組結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)預(yù)期的改動。

動態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（Proteinstructurethroughtime）

時(shí)間分辨晶體學(xué)的進(jìn)步讓我們可以追蹤更多蛋白結(jié)構(gòu)的快速改變。

蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)為生物學(xué)家提供了更多發(fā)現(xiàn)其功能的機(jī)會，但研究人員可以通過觀察蛋白質(zhì)的變化來獲得更深入的見解。然而，檢測稍縱即逝的中間構(gòu)象狀態(tài)是一個很難克服的實(shí)驗(yàn)挑戰(zhàn)。

研究蛋白質(zhì)動力學(xué)的一種方法是時(shí)間分辨X射線晶體學(xué)（TRX）。在TRX的研究中，一個激光脈沖用以觸發(fā)反應(yīng)，然后X射線“探針”脈沖被施加來收集反應(yīng)過程中的一系列衍射圖案。過去在執(zhí)行這種實(shí)驗(yàn)需要高度專業(yè)的同步輻射源。這些儀器具有約100皮秒“速度限制”，這不無法支持變化很快的構(gòu)象可視化。但現(xiàn)在，最新進(jìn)展??超快X射線自由電子激光（XFELs）使其成為可能，它能提供飛秒級的時(shí)間分辨率，讓研究人員可以解決任何其他方法無法檢測到的非常迅速的結(jié)構(gòu)變化。

例如，在2014年，研究人員使用XFEL為基礎(chǔ)的TRX來追蹤處于光催化水分解過程中的光系統(tǒng)II的快速構(gòu)象變化，實(shí)驗(yàn)的分辨率達(dá)到5.5埃（Nature513，261-265，2014）。隨后，一個團(tuán)隊(duì)也用了這種方法來研究光敏蛋白的光周期，在1.6埃分辨率下找到了反應(yīng)中間體（Science346，1242?1246，2014）。2015年，另一組人利用超快XFEL脈沖來追蹤肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)變化（Science，350，445-450，2015）。鑒于XFEL儀器在全世界范圍數(shù)量較少，這種實(shí)驗(yàn)的普及范圍相比TRX實(shí)驗(yàn)并不廣。因此，可用于TRX實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集的任何標(biāo)準(zhǔn)的同步輻射源，將更有利于進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，因而是一個更受歡迎的發(fā)展（Nat.Methods11，1131?1134，2014）。雖然該技術(shù)的時(shí)間分辨率還沒有被證明與XFEL一樣好用，但未來的發(fā)展可能會改進(jìn)這種方法�？吹絋RX技術(shù)被廣泛的使用一定會很有趣，特別是看到研究人員如何調(diào)試方法來研究非光激發(fā)的蛋白質(zhì)的超快反應(yīng)。

精準(zhǔn)光遺傳學(xué)（Precisionoptogenetics）

細(xì)胞水平上對神經(jīng)元的光遺傳學(xué)控制在神經(jīng)微電路的解析領(lǐng)域中很有前景。

2015年是將channelrhodopsin2（ChR2）引入到神經(jīng)科學(xué)的10周年。ChR2已被證明是一種強(qiáng)大的工具，不僅能用于刺激神經(jīng)元，而且也能推動其他光遺傳學(xué)工具的研發(fā)。通常情況下，這些工具能夠用于多個領(lǐng)域，尤其適用于遺傳定義神經(jīng)元的表達(dá)。但要想對神經(jīng)回路有更詳細(xì)的了解，模式照明方案就可以派上用場，這些方案可以讓人們操縱特定物種的神經(jīng)元亞群的活性。

所需的照射樣式可以以不同的方式產(chǎn)生。用快速掃描鏡照明是一種方式，由計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的全息圖案可以通過空間光調(diào)制器來產(chǎn)生。此外，照明方案需要與神經(jīng)活動光學(xué)輸出結(jié)合起來，這往往需要用到光遺傳活化。這并不容易且需要優(yōu)化，這是由于光遺傳學(xué)活化劑和活動傳感器之間的光學(xué)交流干擾。

最近推出的一些方法為研究人員提供了各種戰(zhàn)略。通過將一束有兩個光子的激光聚焦到胞體的大小并在快速掃描鏡（Nat.Neurosci.17，1816?1824，2014）的幫助下在不同的神經(jīng)元之間的切換來實(shí)現(xiàn)兩個神經(jīng)元幾乎同時(shí)的照明。人們也可以通過將一個雙光子束分成多個子束，并用空間光調(diào)制器將它們定位到感興趣的神經(jīng)元上（Nat.Methods12，140?146，2015）來實(shí)現(xiàn)同時(shí)照明。在這兩項(xiàng)研究中，紅移光遺傳執(zhí)行器（C1V1）的使用減少了檢測神經(jīng)活動的綠色鈣指示器的光干擾。在無行為動物中，纖維內(nèi)窺鏡（fiberscopes）可以通過傳遞單光子照明實(shí)現(xiàn)相同的模式（(Neuron84，1157?1169，2014）。

細(xì)胞水平的光遺傳學(xué)將繼續(xù)推動我們對神經(jīng)亞群多樣性和功能的理解。然而，這些方法只能在單一的二維平面上刺激神經(jīng)元，然而神經(jīng)元的通信和工作卻是在大腦的三維環(huán)境中進(jìn)行的。將這些光刺激的方法提升到三維很可能會開辟探測神經(jīng)元新的可能性。

高度復(fù)合成像（Highlymultiplexedimaging）

單細(xì)胞多靶點(diǎn)成像方法打破了顏色障礙。

可視化生物結(jié)構(gòu)的一個主要障礙是熒光光譜的重疊。這種“顏色障礙”實(shí)際上將大部分實(shí)驗(yàn)限制到只能進(jìn)行三或四個靶點(diǎn)的測試。但是，如果我們能看到許多顏色的細(xì)胞呢？復(fù)合成像可以在更有意義的情景中觀察結(jié)構(gòu)，并讓我們更好分析多成分復(fù)合物如何在細(xì)胞中形成和改變。它有望改變我們對生物學(xué)過程的理解。

現(xiàn)在有幾種策略可以解決復(fù)合成像問題。開發(fā)者正在設(shè)計(jì)更好的探針；這其中包括了橫跨可見光和更多的色彩范圍的探針，以及如細(xì)胞內(nèi)微型激光器這樣的探針（Nat.Photonics9，572?576，2015；NanoLett.15，5647?5652，2015），這類探針有非常窄的色譜，因而彼此區(qū)分比較容易。這些探針的改進(jìn)可以讓標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡呈現(xiàn)更好的復(fù)合圖像。

研究人員還開發(fā)光學(xué)設(shè)備來檢測重疊熒光。例如，KeXu和他的同事開發(fā)了SR-STORM顯微鏡，該款顯微鏡通過真彩高分辨率成像來測量標(biāo)記分子的位置和光譜（Nat.Methods12，935?938，2015）。有了這樣的方法，即使高光譜重疊的熒光也可以被很容易地識別，這打開了復(fù)合成像的大門。

高度復(fù)合免疫熒光成像方法也在不斷出現(xiàn)。在這些方法中，用抗體標(biāo)記一些靶點(diǎn)并成像，接著，這些探針被漂白或剝離，然后對不同的靶點(diǎn)重復(fù)同樣的標(biāo)記過程。這就通過多次步驟建立高度復(fù)合顏色的圖像。

一個相關(guān)的策略已經(jīng)用于高度復(fù)合轉(zhuǎn)錄組成像中，在這個方法中，每個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過一個獨(dú)特的條碼識別（Nat.Methods11，360?361，2014；Science348，aaa6090，2015）。在zhuang實(shí)驗(yàn)室MERFISH方法中，成千上萬的轉(zhuǎn)錄物只用一個顏色成像。

雖然這些方法都很強(qiáng)大，活細(xì)胞復(fù)合成像仍然需要改進(jìn)方法�；铙w細(xì)胞方法和固定細(xì)胞方法有相同的問題，但它們也有其他挑戰(zhàn)，如有用的熒光染料和探針的范圍較小、需要快速獲取圖像，以及對光線的敏感。實(shí)現(xiàn)大規(guī)模復(fù)合成像的方法會繼續(xù)被研發(fā)，以推動對生物過程的研究。

蛋白定位亞細(xì)胞圖譜（Subcellularmaps）

系統(tǒng)繪制蛋白質(zhì)在細(xì)胞中分布的方法也在不斷發(fā)展。

人類幾個世紀(jì)以來一直在繪制地球，海洋和天空，但最近幾十年，我們才擴(kuò)大范圍，從分子水平上探索細(xì)胞。

不僅僅是細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)也是嚴(yán)密的。它們被區(qū)分為細(xì)胞器和有特定分子組成和物理性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，并且它們也是動態(tài)的，任一時(shí)間段內(nèi)進(jìn)入和離開它們的分子數(shù)量是穩(wěn)定的。毫無疑問，細(xì)胞過程依賴于其結(jié)構(gòu)：細(xì)胞分泌，需要通過一系列的膜結(jié)構(gòu)才能發(fā)生；許多信號過程是通過分子支架來完成的。甚至基因表達(dá)也與基因組的空間結(jié)構(gòu)有錯綜復(fù)雜的聯(lián)系。盡管細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白定位從細(xì)胞生物學(xué)出現(xiàn)開始就一直是研究熱點(diǎn)，用于繪制整個細(xì)胞的蛋白分布系統(tǒng)分子地圖的技術(shù)方法仍在發(fā)展。

在早期的工作中，人們先進(jìn)行細(xì)胞分餾，隨后對蛋白質(zhì)位置進(jìn)行生化分析，這其中主要用了質(zhì)譜方法（Cell125，187-199，2006）。在系統(tǒng)中使用Workhorse方法，如以抗體為基礎(chǔ)的免疫組化方法，以產(chǎn)生亞細(xì)胞圖譜。還有遺傳編碼工具，如抗壞血酸過氧化物酶和生物素連接酶，都可以用在生物素化分析方法中，還有捕獲和質(zhì)譜法，用以確定在細(xì)胞特定位置有哪些蛋白（Science339，1328?1331，2013；J.CellBiol.196，801?810，2012）。這些工具一直在被改進(jìn)（Nat.Methods12，51?54，2015），并開始在亞細(xì)胞圖譜實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用（(Proc.Natl.Acad.Sci.USA112，12093?12098，2015）。

雖然蛋白質(zhì)位置的亞細(xì)胞地圖會讓我們看到前所未有的圖像，但是蛋白質(zhì)只是組成這種圖像的為數(shù)不多的一種分子類型。然而，在對細(xì)胞的探索中，蛋白質(zhì)圖譜肯定是開始的地方。

綜合單細(xì)胞圖譜（Integratedsingle-cellprofiles）

單細(xì)胞的綜合分子圖譜將為基因調(diào)控和異質(zhì)性提供關(guān)于其機(jī)制的見解。

就像一副新眼鏡，單細(xì)胞測序正被越來越多的科學(xué)家使用來重新審視他們的研究。在細(xì)胞的水平上檢查組織可以深入了解異質(zhì)性，還可以讓研究人員能夠直接定義細(xì)胞，這其中包括通過比較分子狀態(tài)來定義新細(xì)胞類型。單細(xì)胞DNA和RNA測序方法日趨完善，并且近期有很多表觀遺傳學(xué)方法達(dá)到了單細(xì)胞的里程碑。我們期待著表觀遺傳分析更進(jìn)一步，以及出現(xiàn)從同一細(xì)胞中提取多個圖譜的新方法。

在單個細(xì)胞中進(jìn)行RNA測序已經(jīng)可以很強(qiáng)大而常見了，而且也有可能大規(guī)模使用；可以用它來得到表型進(jìn)而推斷細(xì)胞的身份和功能�，F(xiàn)在，研究單細(xì)胞基因調(diào)控的方法包括了對DNA甲基化，進(jìn)入染色質(zhì)，組蛋白修飾和染色體結(jié)構(gòu)的研究。雖然成就是非凡的，這些方法大多數(shù)將受益于更大的基因組覆蓋范圍和更清晰的信號。解析問題還需要解決；高技術(shù)的噪音，由于欠采樣和生物變化（例如，來自細(xì)胞周期的不同，批次效應(yīng)和生化隨機(jī)性）而造成的數(shù)據(jù)稀疏性問題是其中的一些挑戰(zhàn)。

從大量的表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)中找出機(jī)制或因果關(guān)系被證明很難。許多數(shù)據(jù)類型是相關(guān)，并在許多細(xì)胞群中與基因表達(dá)有復(fù)雜的關(guān)系。提取表觀遺傳學(xué)特征和相同細(xì)胞的RNA有可能是找到“表觀遺傳狀態(tài)如何影響基因表達(dá)，或者RNA如何響應(yīng)表觀遺傳學(xué)的變化”的更直接的方法。此外，基因表達(dá)原則上可以用于將細(xì)胞分配到亞種類中，用其他論文中的表觀遺傳學(xué)特征進(jìn)行單細(xì)胞RNA分析比對??例如，在一個實(shí)驗(yàn)中的DNA甲基化過程和另一個中的DNA可進(jìn)入性過程??可以識別每個亞群中表觀遺傳特征的關(guān)系，以及它們在基因表達(dá)的潛在作用。

單細(xì)胞方法對干細(xì)胞生物學(xué)的研究、發(fā)展，還有對組織異質(zhì)性的研究非常重要。有了足夠的樣本，就有可能解決表觀遺傳如何影響各個位點(diǎn)的基因表達(dá)。